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    Revista SCientifica

    versión impresa ISSN 1813-0054

    SCIENTIFICA v.5 n.5 La Paz sep. 2007

     

    ARTICULO ESPECIAL

     

    METABOLISMO DE PROTEÍNAS EN NIÑOS RESIDENTES DE GRAN ALTITUD: ESTUDIO PILOTO SOBRE LA UTILIZACIÓN DE TÉCNICAS CON ISÓTOPOS ESTABLES

     

     

    Dr. José Luis San Miguel Simbrón.
    Docente Investigador Titular
    Jefe de la Unidad de Crecimiento y Desarrollo
    Instituto de Investigación en Salud y Desarrollo, IINSAD.
    Profesor de la Cátedra de Fisiología, Facultad de Medicina.
    Universidad Mayor de San Andrés.
    La Paz, Bolivia.

     

     


    RESUMEN.

    El metabolismo de las proteínas es complejo de ser estudiado en condiciones de campo en países en vías de desarrollo, la utilización de las proteínas durante la alimentación es dificultosa de ser estudiada a través de la metodología clásica de los trazadores isotópicos. En este estudio se propone una nueva metodología utilizando la medición de la recuperación de un trazador como el 13C (en el aire expirado 13CO2), después de una ingestión de una dosis oral simple de proteína de leche marcada con Leucina-13C. La proteína marcada con 13C fue obtenida post infusión a una vaca con Leucina-13C. La diferencia entre la cantidad dada del trazador y la cantidad recuperada en el aire espirado, es un índice de la utilización de la proteína. Se ha demostrado como puede implementarse esta metodología no invasiva para evaluar la absorción y la utilización de la proteína a gran altitud al haberse ejecutado dicho estudio en niños nativos y residentes de 3600 metros sobre el nivel del mar.

    Palabras Clave: Metabolismo proteico, isótopos estables, oxidación de la leucina, altitud.


    ABSTRACT.

    Protein metabolism is very complex to asses particulary under field conditions in undevelopment countries. Protein utilization during feeding is difficult to asses by classical tracer methodology. The propone of a new approach using the measurement of tracer recovery 13C (expired 13CO2), after the ingestion of a single oral dose of a 13C-Leucine labelled milk protein. Protein will be obtained by infusion a cow with 13C-Leucine. The difference between the amounts of tracer given and recovered should be and index of protein utilization. The dates demonstrated how is possible the implementation of this new methodology for the evaluation of the protein absorption and his utilization at high altitude, this non-invasive method was execute in children native and living at 3600 m of altitude.

    Key Words: Protein turnover, stable isotopes, leucine oxidation, altitude.


     

     

    INTRODUCCION

    Durante la aclimatación a grandes altitudes, se ha verificado que el metabolismo basal esta elevado y esta incrementado el gasto energético1-3.

    Estudios en adultos muestran que el metabolismo proteico esta también afectado ante una exposición aguda a la hipoxia hipobárica, el recambio de la leucina y la síntesis de la glutamina estan afectados 4'5. En niños nativos y residentes permanentes de gran altitud no se ha estudiado el metabolismo proteico. Muchos estudios realizados con trazadores sobre la cinética de proteinas y aminoácidos han sido conducidos en un estado post-absortivo, sin embargo este estado solamente representa aproximadamente una cuarta parte del estado nictemeral. El escaso número de estudios en el estado del proceso alimentario se debe a las dificultades metodológicas que dichos estudios implican. La cinética de los trazadores es calculada al estado de equilibrio, esto implica que ambos el isótopo y el substrato alcanzan una meseta durante la alimentación. Usualmente lo antes mencionado es obtenido de las siguientes maneras, sea por una infusión enteral nasogástrica realizada durante 3 a 5 horas 6,7 o mediante la administración de pequeñas comidas cada 15-30 minutos8. En ambos casos, el estado de equilibrio obtenido por el isótopo y el substrato, son algunas veces no perfectos y más importante aún el hecho que estas mal llamadas "comidas" pueden no reflejar lo que pasa realmente durante una comida "normal", ello es justificado por las dos siguientes razones:

    Las modificaciones en la cinética de los aminoácidos son estudiadas después de 3 a 4 horas de una alimentación, y por consiguiente no indica que esta pasando durante las primeras horas de alimentación. Por ejemplo en uno de los estudios de Beaufrere et al,6, durante la administración continua de 15 mg de N/kg/h, los aminoácidos plasmáticos en los que esta incluido la Leucina, pueden incrementarse durante las 2 primeras horas, pero vuelven a la línea de base o más abajo cuando ha sido realizada la medición de la cinética, que podría ser a las 3 a 4 horas.

    Fisiológicamente los cambios hormonales, y particularmente la secreción de insulina, son muy diferentes durante una infusión continua de una comida que durante una sola comida. Debido a la continua estimulación de las células por la administración de carbohidratos, se produce un incremento de la insulina plasmática y usualmente permanece elevada durante el período del estudio, esta es una situación diferente a la que se presenta durante una comida estandar en la que se observa, desde un pico a un rápido retorno a la línea de base, en la secreción de la insulina.

    Otro importante aspecto es el trazador a ser usado. En pocos estudios8'7'8, dos trazadores del mismo aminoácido, usualmente la Leucina, son administrados simultaneamente por vía oral y endovenosa. Esto permite el cálculo de la extracción esplácnica de los aminoácidos por el intestino y el hígado, y probablemente da una estimación más segura de la proporción de la leucina endógena y un índice del catabolismo proteico corporal total, siendo esta metodología invasiva. Sin embargo, el principio más básico de la metodología de los trazadores es que el trazador y lo trazado tienen la misma conducta metabólica. En la ausencia de disponibilidad comercial de proteinas marcadas, la regla no es respetada cuando se administra oralmente aminoácidos marcados libres, por ejemplo la Leucina marcada con 13junto con una proteina no marcada 7,8, en este sentido esta bien demostrado que la absorción de aminoácidos libres puede ser muy diferente a la absorción de aminoácidos derivados de una proteina, debido a la existencia de transportadores específicos para los di y los tri péptidos a nivel de los enterocitos. Por otro lado, en algunos estudios, el nitrogeno fue dado como una mixtura de aminoácidos libres 6,9. En este caso el trazador es actualmente representativo de lo trazado, sin embargo tales dietas alimenticias no son fisiológicas y algunas veces pobremente toleradas.

    Por último, estudios sobre la utilización de las proteinas durante una comida son más dificultosos bajo condiciones de campo. El concepto de trabajo bajo condiciones de campo, debe comprenderse como la situación de trabajo con niños en países en vías de desarrollo en zonas desfavorecidas, junto a los componentes socio-culturales, económicos que hacen dificultoso y no bien comprendido el trabajo de investigación.

    El balance nitrogenado demanda mucho tiempo, garantizar la recolección de orina, heces y la cuantificación de proteinas ingeridas son extremadamente dificultosas. La metodología de productos finales en el uso de los trazadores encuentra los mismos problemas, sin embargo en un menor grado por la necesidad de una duración de recolección más corta, y en adición tendría una crítica de las bases conceptuales. Finalmente, lo descrito más arriba en relación a los estudios realizados durante la alimentación con trazadores de la leucina son casi imposibles de llevarse a cabo en condiciones de campo (entiendase también como "condiciones de campo" a los aspectos socio-culturales de las población y más en niños) debido a que se requiere la administración endovenosa de trazadores y a la toma frecuente de muestras sanguíneas.

    En conclusión, los actuales métodos de estudio de la utilización de proteinas durante la alimentación estan plagados de dificultades conceptuales y prácticas. En el presente estudio piloto se propone un nuevo acercamiento para estudiar el metabolismo proteico corporal total durante la administración de una sola comida por vía oral, usando una proteina marcada con el 13C.

    Esta analizado y concensuado el hecho que la malnutrición en Bolivia es un problema mayor de salud pública, más aún a grandes altitudes. Este fenómeno resulta de una interacción de efectos, que podría resumirse en 4 factores, a saber:

    • Una ingesta inadecuada de proteinas y energía.

    •Infecciones bacterianas crónicas y/o infecciones agudas frecuentes

    •Infección parasitaria múltiple crónica.

    •Residencia a gran altitud, en un medio ambiente citadino, principalmente en grupos poblacionales desfavorecidos que viven a más de 3600 m de altura.

    El objetivo fue determinar la posibilidad de implementar una nueva metodología no invasiva para evaluar la síntesis y absorción de las proteinas en niños sanos, de nivel socio-económico medio a alto, nativos y residentes permanentes de altitud, mediante la utilización de un trazador isotópico estable 13C (Leucina-13C).

     

    MATERIAL Y METODOS.

    Consentimiento informado de los padres.

    Teniendo en cuenta las consideraciones éticas, primero se ha obtenido el consentimiento informado de los padres estableciendose que el método utilizado era no traumático, no invasivo, se ha explicado el protocolo de investigación que justifica la inocuidad de estos trazadores denominados isótopos estables, mismos que no son radioactivos, así mismo se utilizó referencias de nivel internacional y se obtuvo una certificación escrita del Instituto Boliviano de Ciencia y Tecnología Nuclear (IBTEN) sobre la inocuidad del "C. Así mismo se obtuvo el asentimiento del niño para ser parte del estudio. Solamente cuando este asentimiento del niño y el consentimiento informado fue obtenido de los padres, el niño ingreso en el protocolo de estudio. El estudio fue aprobado por el Consejo Técnico del Instituto Boliviano de Biología de Altura (IBBA).

    Lugar del estudio.

    Se realizó el presente estudio piloto en la ciudad de La Paz a 3600 metros sobre el nivel del mar, en uno de los institutos de la Facultad de Medicina.

    Los sujetos del estudio propuestos fueron 4 niños, varones, sanos, eutroficos, de nivel socio-económico medio a alto, de 8 a 10 años de edad cumplidos, de los cuales pudieron ser estudiados solo 3 niños, con características similares.

    Se realizó una evaluación clínica pediátrica, en la que además se estableció que no existieran signos clínicos de malnutrición, con medidas antropométricas de peso y talla y la subsiguiente derivación a índices nutricionales como Peso/Edad, Talla/Edad y Peso/Talla dentro del rango normal de la referencia del NCHS ( > -2 DS y < +2DS ), haber nacido y ser residente permanente de gran altitud (La Paz), y no haber viajado a baja altitud durante los últimos 6 meses.

    Así mismo, se determino que debían cumplir con criterios de exclusión intraestudio, estos criterios eran de suma importancia, y fueron: haber vomitado la proteína (caseína) ingerida, haber retenido su respiración durante la recolección de aire espirado, haber hiperventilado.

    La antropometría fue realizada, determinandose el peso, mediante una balanza electrónica, con una presición de 0.2 kg (Tefal, Francia). La talla fue medida mediante un tallímetro artesanal con una presición de 1 mm. A partir de estas medidas se obtuvo los índices antropometricos arriba mencionados.

    Medición de la oxidación de la leucina.

    Se logro obtener la asesoría y orientación técnica del Profesor B. Beaufrere, de Clermont Ferrand, Francia, para que el equipo de investigación pudiera implementar la mejor metodología para el diseño del estudio. Durante el mismo era fundamental la obtención adecuada, "sin contaminación", del aire espirado. Para este cometido era necesario utilizar una "boquilla" con un seguro nasal, que no permitió una recuperación adecuada del 13CO2 espirado. Posteriormente se adquirió una máscara pediatrica que permitió una buena recolección del aire espirado (ver más adelante).

    El principio de este nuevo método de estudio fue medir la oxidación total de leucina después de una sola carga oral de una proteina de alto valor biológico, en esta proteina las leucinas fueron marcadas con 13C en la primera posición.

    El destino metabólico de la leucina ingerida es, la incorporación en la síntesis de proteinas o la degradación irreversible por decarboxilación en la posición C1, con la consiguiente producción de 13002. Con este método la cantidad total de 13002 espirado fue calculado como el área bajo la curva del incremento de V13CO2 que se desarrolla sobre la línea de base durante las horas posteriores a la ingestión de caseína. De lo anterior se establece que la diferencia entre la cantidad del trazador dado y la cantidad del trazador recuperado permite obtener la cantidad de la proteina ingerida que ha sido utilizada para la síntesis proteica.

    La síntesis de la proteina marcada con 13C-Leucina fue producida durante una infusión intravenosa contínua de 24 horas de 13C-Leucina a una vaca lechera, de ella se recolectó la leche, se realizó la separación por ultrafiltración y purificación de dos fracciones principales de proteinas de la leche i.e. la caseína y lactoserum. La producción de la leche marcada ha sido realizada en colaboración con el Laboratorio de Tecnología Láctea (J.L. Maubois, Rennes, Francia).

    El método no es invasivo, fue realizado bajo las condiciones de campo y bajo condiciones culturales de nuestro medio. Se realizó la medición de la leucina total a nivel corporal después de la ingesta de una carga oral de una proteina de leche = caseína, marcada con L-[1-13C] leucina.

    La oxidación de la leucina exógena es medida en el CO2 espirado, como el producto de VCO2 por la medida del enriquecimiento por 130-002, mediante la espectrometria de masa (isotope ratio mass spectrometry, IRMS). La oxidación total de la leucina es calculada como el área bajo la curva del incremento progresivo por encima de la línea de base del V13002.

    La medición de la oxidación de la leucina ha sido llevada a cabo como sigue:

    Después de un ayuno breve, que corresponde a un estado postabsortivo, posterior a una cena habitual del niño, en la mañana se recogió del niño en ayunas, 2 veces todo el aire espirado en bolsas de Douglas durante 5 minutos. Luego se dió una carga oral de caseína marcada de 0.5 g/kg de peso, disuelta en 200 ml de agua. La ingesta duró un promedio de 5 minutos. 30 minutos después de la ingesta se inició la recolección periódica del aire espirado, durante las 3 primeras horas cada 30 minutos durante 5 minutos y en las siguientes 3 horas cada 60 minutos de la misma manera.

    Nota: El gran problema consistía en evitar al máximo la posible contaminación con CO2 el aiere espirado por cada niño, a la altura de 3600 metros, ello fue posible gracias a la utilización de una máscara de goma, plenamente ajustable a la cara del niño. Se verifico que no solo era necesario utilizar pinzas que ajusten el nivel nasal del niño, sino que también se estableció que era necesario tener un ayudante del equipo de investigación que sostuviera la máscara, además de su sujetador elástico, con una mano y que con la otra posicionara de la mejor manera la cabeza y el cuello del niño durante los 5 minutos de recolección del aire espirado por el niño. También este ayudante tranquilizaba al niño durante esta recolección.

    Otro componente importante, era saber y poder traspasar el aire colectado de la bolsa de Douglas, a los Vacutainers de 10 mL, que se encontraban asegurados al vacio con una tapa hermética de goma. Para este proceso, se realizaron varias pruebas que consistían en utilizar agujas de grueso calibre que permitían traspasar el aire desde la bolsa de Douglas hacia los vacutainers, ello mediante una primer aguja proveniente de la bolsa de Douglas que se insertaba en la tapa de goma del vacutainer y que insuflava al vacutainer y al mismo tiempo se colocaba una segunda aguja en la tapa de goma del vacutainer, que permitia la salida del aire que estaba entrando por la primer aguja desde la bolsa de Douglas, es decir el vacutainer era en un momento como un espacio por el que circulaba aire proveniente de la bolsa de Douglas ( que contenía el aire espirado del niño ), esa salida de aire del vacutainer podía ser verificada por la presión de flujo de aire sentida en el dorso de la mano del operador. Luego se procedía a retirar rápidamente la segunda aguja y posteriormente la primer aguja de la tapa de goma del vacutainer ( para mantener lleno del aire espirado al vacutainer).

    En etapas previas se ha desarrollado el llenado de vacutainers con humo blanco, que permitía verificar que esta técnica arriba indicada funcionaba en nuestro medio, en última instancia lo que se hacia era "embotellar aire en los vacutainer", el vacutainer contenía 002, por lo tanto contenía 13C que fue analizado en laboratorios del extranjero. Así mismo, la caseína que fue marcada previamente con 13C, en la Leucina, tenía una característica física de pequeñas hojuelas, muy finas, que al inicio presentaban dificultades para su ingesta. Se realizaron pruebas para lograr la mejor mezcla con un líquido, habiéndose elegido para ello agua hervida entibiada, para obtener una mezcla homogénea haciendo tolerable su ingestión.

    De cada recolección de aire se transfirieron 2 muestras en vacutainers de 10 ml, sin aditivo. El análisis del 133002en estas muestras fue realizado en el Laboratorio de Nutrición Humana en Clermont-Ferrand, Francia (Microgas + Optima IRMS, VG instruments).

    Cada bolsa de Douglas de aire espirado (en total 11 bolsas por niño) fue analizada por su contenido de CO2 (Capnograph Gould Godard Mark III ) y de 02 (Servomex A570). El volúmen de aire espirado fue medido en un espirómetro Tissot de 100 L. El VCO2 fue obtenido multiplicando el volúmen de aire espirado por la fracción espirada de CO2 y expresado en condiciones STPD. El VO2 se calculó mediante la fórmula de Fick con el objetivo de tener la seguridad de datos confiables. El V13CO2 fue calculado en base al VCO2 y la concentración de 13CO2 en aire espirado.

    La cantidad total de 13CO2 espirado fue calculada como el área bajo la curva de incremento de V13CO2 sobre la línea de base, durante las horas que siguieron a la ingesta de caseína. La diferencia entre la cantidad de trazador dado y la cantidad de trazador recuperado indica la cantidad de la fracción de la proteina ingerida utilizada para la síntesis proteica.

    RESULTADOS.

    Habiéndose logrado desarrollar una técnica adecuada para colectar el aire espirado, evitando la contaminación con el CO2 a gran altitud, se pudo obtener el siguiente resultado, el V13CO2 retorna a la línea de base luego de 5 horas postingesta de la caseína, y el valor máximo de 13CO2 aparece entre los 90 a 150 minutos de iniciada la prueba. (Fig.1) En un caso se ha verificado que el 34.44 % del trazador ingerido fue recuperado y por lo tanto se infiere que el 65.56 % de la Leucina marcada con 13C, fue utilizada para la síntesis proteica a gran altitud. (Fig.2)

    DISCUSION.

    El metabolismo proteico, estudiado por medio de la Leucina marcada con un isótopo estable (13C), evaluada mediante la técnica desarrollada en nuestro medio, ha permitido verificar el inicio de la absorción de proteínas y el momento final de la desaparición de las proteinas en alrededor de las 6 horas post ingesta de la caseína. (Fig.1) El equilibrio energético es muy difícil de mantener por arriba de los 4500 m de altitud, en parte debido al hecho del aumento del gasto energético y a un bajo aporte de energía10. Los niños de nivel socio-económico alto no presentan este desequilibrio energético 11. La digestibilidad de alimentos podría estar disminuída a gran altitud 12. Una encuesta alimentaria realizada en La Paz ha mostrado que el promedio de ingesta de proteinas en los niños de alto nivel socio-económico es de 93 ± 27 g 13. Por lo tanto la ingestión de proteinas es elevada (3g/kg/día), esto sugeriría que una parte de las proteinas posiblemente no es absorbida. Es posible que esto sea debido a un efecto de la hipoxia y de la actividad muscular sobre el metabolismo de proteinas 14. En efecto, la pérdida de masa muscular es común en los alpinistas 10. Por otra parte la hipoxia aguda reduce el recambio de la leucina 15 y disminuye la síntesis de proteinas en el animal16. Ha sido demostrado que la hipoxia crónica hipobárica produce modificaciones del metabolismo de las proteinas17.

    En un estudio anterior de la Unidad de Nutrición se ha mostrado que el crecimiento físico de los niños prepúberes depende del nivel socio-económico y no de la altitud de residencia18. Por otro lado la absorción de las proteinas en niños de bajo nivel socio-económico es baja probablemente en parte a causa de las parasitosis intestinales, que serían responsables de la malabsorción de estas proteinas 19.

    La implementación de una nueva metodología no invasiva para evaluar la síntesis proteica, a través de la medición de la oxidación de la Leucina marcada con el isótopo estable 13C, fue posible en niños bolivianos de edad escolar, nativos y residentes permanentes de gran altitud (3600 m.s.n.m.). Esta nueva metodología permitirá estudiar y responder posiblemente los conceptos vertidos más arriba, mediante la ejecución de diferentes proyectos con el uso de isótopos estables.

    El uso de los isótopos ha revolucionado el campo de la nutrición humana, se ha obtenido un gran beneficio al investigar con estos marcadores en países desarrollados. La Agencia Internacional de Energía Atómica, esta apoyando programas como en Bolivia, en los que se usan los isótopos , relacionando tecnologías en investigación en nutrición humana dirigidas a temáticas que son prioridades en países en desarrollo. Los científicos que participan en el nuevo Programa de Investigación Coordinada (CRP), sobre el metabolismo de aminoácidos y proteínas en poblaciones malnutridas de países en desarrollo, están conduciendo investigaciones, sobre la interacción entre la infección y el metabolismo de aminoácidos, particularmente el potencial de desvió de substratos desde caminos anabólicos hacia la lucha contra la infección, en niños marginalmente alimentados durante períodos de inmunoestimulación. Este tópico es de gran importancia en el estado nutricional de los niños en países en desarrollo, quienes están frecuentemente o crónicamente inmunoestimulados y en quienes, como consecuencia podría haber alteraciones en sus requerimientos de nutrientes. El CRP esta expectante a contribuir con conocimiento nuevo e importante a cerca de la interacción entre la utilización de nutrientes, el stress de los medio ambientes no higiénicos, y las infecciones en poblaciones marginalmente nutridas. Esta información espera ser aplicable a los esfuerzos que se hacen para incrementar la utilización eficiente de las fuentes de alimentos limitadas en países en desarrollo.

    Otro aspecto interesante del CRP, es que este representa un equipo internacional de investigadores en nutrición, quienes juntos están construyendo capacidades de investigación en biología nutricional en países en desarrollo.

     

    AGRADECIMIENTO.

    Un gran agradecimiento a los niños y a sus padres, ya que sin la ayuda de ellos, no habría sido posible dar el primer y más importante paso en el presente estudio. Al Profesor Bernard Beaufrere, el mayor reconocimiento, mi agradecimiento y mis honras postumas, que en la paz de Dios descanse, ya que fue mi asesor y profesor en esta nueva metodología de uso de isótopos estable como el "C, base para estudiar problemas predominantes de salud en nuestros niños y niñas.

    Así mismo, un agradecimiento especial para la Dra. Hilde Spielvogel, Jefe del Laboratorio de Bioenergética, del IBBA, por su apoyo y cooperación constante en toda esta investigación.

     

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