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    BIOFARBO

    versión impresa ISSN 1813-5363

    BIOFARBO v.17 n.2 La Paz  2009

     

    TRABAJOS DE INVESTIGACIÓN

     

    Tipificación molecular de Mycobacterium tuberculosis en los departamentos de Cochabamba, La Paz y Santa Cruz

     

    Molecular tipification of Mycobacterium tuberculosis in Cochabamba, La Paz and Santa Cruz

     

     

    Zulema Bustamante G. 1, Michal Svoboda2

     

    1Laboratorio de Biología Molecular, Facultad  de Bioquímica y Farmacia, Universidad Mayor de San Simón.

    2Laboratorio de Química Biológica, Facultad de Medicina, Universidad Libre de Bruselas

     

    Dirección para Correspondencia: Zulema Bustamante M.Sc. Facultad de Bioquímica  y Farmacia. Universidad Mayor de San Simón. Av. Aniceto Arce s/n.
    Tel: 4250651

    E mail: zulebust@hotmail.com

     

    Recibido para publicación en 6/07/09
    Aceptado en 2/12/09

     

     


    RESUMEN

    El presente trabajo tuvo por objetivo determinar los genotipos  de cepas de Mycobacterium tuberculosis de los departamentos de Cochabamba, La Paz y Santa Cruz, aplicando la técnica ÍS6110-PCR, previamente adecuada y validada por la técnica IS6110-RFLP. Se trabajó con  72 aislamientos, los resultados mostraron  nueve perfiles de bandas diferentes, permitiendo agrupar a Mycobacterium tuberculosis, en  9 genotipos, encontrando variabilidad de acuerdo al área geográfica. En el departamento de  Cochabamba predomina el genotipo I, seguido  del III  y VII; en Santa Cruz el I  y en La Paz los genotipos III y II.

    La  técnica estandarizada IS6110-RFLP permitió validar la IS6110-PCR, existiendo correlación entre ambas técnicas; demostrando además la presencia de varias copias  de IS6110, generalmente  en un número mayor a  6 y menor a 10.

    Palabras Clave: IS6110; genotipos, PCR-RFLP


     ABSTRACT

     This work aims to determine the Mycobacterium tuberculosis genotypes in Cochabamba, La Paz, and Santa Cruz by applying the IS6110-PCR technique, previously standardized and later validated by the IS6110-RFLP technique.

    Seventy two samples of the bacteria under study were tested and the results revealed nine profiles of different bands.  Thus, Mycobacterium tuberculosis could be grouped in nine genotypes that show variability according to the geographical area.  Genotype I, followed by III and VII, predominates in the area of Cochabamba; genotype I in Santa Cruz; and genotypes III and II in La Paz.

    The IS6110-RFLP standardized technique allowed the validation of the IS6110-PCR, revealing a correlation between both techniques.  Moreover, The IS6110-RFLP standardized technique also showed the presence of several copies of IS6110 in a number greater than six and lesser than ten.

    Key Words: IS6110; genotypes, PCR-RFLP


     

     

    INTRODUCCIÓN

    La tuberculosis es una enfermedad de los pulmones, contagiosa, crónica y severa, que presenta un cuadro clínico inmunológico complejo; ataca a un alto porcentaje de la población y es causada por  Mycobacterium tuberculosis, conocido como Bacilo de Koch.

    A pesar de que hace  muchos años  se conocen drogas, tratamientos eficaces y procedimientos para su control, actualmente nos encontramos ante un   recrudecimiento de la enfermedad en el ámbito mundial, constituyéndose en la infección que más muertes provoca en el mundo1, 2.

    Bolivia es un país que se caracteriza porque todavía tiene una alta incidencia de la tuberculosis pulmonar y cada año se reportan casos nuevos notificados. En el año 2001 se notificaron 10.044, de los cuales el 85% correspondió a tuberculosis pulmonar y el 15% a tuberculosis extrapulmonar,  sin embargo, también existen casos que no son reportados, especialmente en las poblaciones rurales3

    En nuestro país se  han desarrollado varios trabajos microbiológicos con este bacilo, pero trabajos a nivel molecular fueron pocos; por lo que es  necesario realizar estudios para conocer  las características genéticas  y  tipificar las  cepas de M. tuberculosis que provienen de Cochabamba y de otros departamentos, con el propósito de identificar  genotipos circulantes y buscar correlación con zonas geográficas; estos ensayos permitirán realizar estudios epidemiológicos a nivel molecular y, posteriormente, emprender nuevos retos en la solución del problema.

    Para los estudios de genotipificación en M. tuberculosis el marcador molecular más utilizado es la secuencia de inserción IS6110, que se caracteriza porque se presenta en número variable de copias y en diferentes regiones del cromosoma. En base a este marcador la técnica estandarizada  es la que se basa en los fragmentos de restricción de longitud polimórfica, después de una extracción de ADN y digestión con la enzima Pvu II; conocida como IS6110-RFLP4.

    Debido a algunos inconvenientes que presenta la técnica IS6110-RFLP, como ser, el requerimiento de un cultivo masivo de la bacteria, difícil de lograr, el tiempo  y costo, se han ido desarrollando otros métodos alternativos para la tipificación de M. tuberculosis, así como para los estudios epidemiológicos5,6,7,8. Entre estos  se encuentra la técnica IS6110-PCR, utilizada para la tipificación de esta bacteria, que se  basa en el polimorfismo  de las regiones continuas a IS6110.

    Por lo tanto el propósito de esta investigación fue el de determinar el polimorfismo genético en cepas de M. tuberculosis, provenientes de los departamentos de Cochabamba, La Paz y Santa Cruz, utilizando como marcador molecular la secuencia de inserción IS6110.

     

    MATERIAL Y MÉTODOS

    Se trabajó con 72 aislamientos de Mycobacterium tuberculosis, obtenidos de esputos de pacientes con tuberculosis pulmonar, en  la Escuela Técnica de Salud de Cochabamba y el Instituto Nacional de Laboratorios en Salud (INLASA) y derivados al Laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Bioquímica y Farmacia de la Universidad Mayor de San Simón.

    Para la genotipificación de este microorganismo, se utilizaron dos técnicas de tipificación molecular: La IS6110-PCR8 y la IS6110-RFLP4, que fue utilizada para validar la primera. Las técnicas fueron:

    Técnica  IS6110-PCR.  Se adecuó  en nuestras condiciones de laboratorio, los métodos  descritos por Otal 8; Yates 9  y Neimark 10.

    Extracción del ADN:

    Del cultivo de M.tuberculosis,  se tomó  una colonia grande o cuatro pequeñas,  se colocaron  en el buffer Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM,  se las hicieron hervir por un tiempo 30 minutos, se agregó cloroformo y se centrífugo a 12.000 rpm, separando la fase acuosa que contenía el ADN.

    PCR para la tipificación de IS 6110:

    Se utilizaron los cebadores CAR 2 A (5’-GAC-TCA-CCG-GGG-TTC-A-3’) y CAR 2 B (5’-GAC-ATG-CCG-GGG-CGG-TTC-A-3’), descritos por Otal8. Los mismos que fueron sintetizados por  EUROGENTEC. Las condiciones de la reacción en cadena de la polimerasa fueron:1 ciclo a 94 °C  por 2 minutos, 40 ciclos de 94 °C por 10 segundos, 62 °C por 20 segundos, 72 °C por 1 minuto y 1 ciclo  a 72 °C por 7 minutos. Los productos de la amplificación fueron separados en gel de agarosa al 1,4% y visualizados con bromuro de etidio de 0,5μg/ml, en un transiluminador de  luz UV.

    Técnica   IS6110 RFLP. Para esta técnica de tipificación se procedió de acuerdo al método descrito por  Van Emden, et al 4, y  las técnicas generales según los procedimientos descritos por Sambrook, et al 11.

    Extracción de ADN:

    Se tomó aproximadamente 3 asas de cultivo bacteriológico, que fueron transferidas  al buffer Tris-HCl 10mM y EDTA 1mM, la mezcla fue calentada, por 20 minutos, se adicionó lisozima  de 10 mg/ml y se incubo por  1 hora a 37 ºC. Se colocó  SDS al 10% y proteinasa K de 10 mg/ml, luego  NaCl  y N-cetil-N-N-N-trimetil amonio CTAB, (4,1 g de NaCl y 10 g de CTAB), se incubó  por 10 minutos a 65ºC. Se adicionó un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y se llevó a un vortex. La mezcla se centrifugó  a 12.000 rpm. La precipitación del ADN se realizó con isopropanol.

    El ADN bacteriano se cuantificó por espectrofotometría de luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm.

    Digestión del ADN con la enzima Pvu II. Para la digestión se utilizó 2 μg  del ADN cromosómico de la bacteria y se incubó con  5  unidades de enzima Pvu II  de 10 U/μl,  en un  volumen final de 10 μl. Los productos de la digestión fueron separados por electroforesis en  gel de agarosa al 1%.

    Transferencia del ADN a membrana de nitrocelulosa. Para la transferencia de los fragmentos de restricción, el gel de agarosa se realizó una desnaturalización alcalina, luego una neutralización y la transferencia, utilizando membrana de nitrocelulosa SIGMA de 0,45 μm de poro y una solución de transferencia.

    Preparación de la sonda IS6110. Para la preparación de la sonda se siguió el procedimiento descrito por Van Embden, et al4, se utilizó el ADN de una cepa de referencia de M. tuberculosis H37Rv y los cebadores: INS 1 e INS 2, que corresponden respectivamente a las regiones 631-650 y 856 a 875 de la secuencia de Inserción IS6110, para la amplificación se utilizó el kit – "PCR DIG PROBE SYNTESIS KIT" de Roche. Las condiciones de amplificación fueron: 1 ciclo a 94ºC por 3 min; 25 ciclos: 94ºC por 30 segundos, 57ºC por 30 segundos, 72ºC por 1 minuto, 1 ciclo  a 72ºC por 7 minutos. Se obtuvo una sonda de 245 pb, marcada con digoxigenina. 

    Hibridación con la sonda IS6110. La hibridación con la sonda IS6110,  se realizó por 12 horas a una temperatura de 55ºC en una solución de hibridación. Para la detección de la sonda, la membrana se  incubó con TBS 0,5% leche en polvo, luego se cubrió con una solución de antiDIG-fosfatasa alcalina en TBS-0,5% leche y se incubó  durante 2 horas, a temperatura ambiente. Para la revelación se utilizó como sustrato Nitroazul de tetrazolium y 4-cloro-5-bromo-Indoilfosfato (BCIP).

    Análisis estadístico.  Para el análisis estadístico de los resultados de IS6110-PCR, se utilizó el programa SAS para realizar una inferencia estadística, determinando el intervalo de confianza a 95% de seguridad y estimar la frecuencia relativa de los genotipos a nivel poblacional. Para la asociación entre genotipos y departamentos, se  realizó un análisis de Chi-cuadrado, en el programa SPSS.

     

    RESULTADOS

    Tipificación por la técnica  IS6110-PCR.  Los productos  de la PCR, mostraron diferentes tamaños y número de bandas, observando  la variabilidad genética entre las diferentes cepas provenientes de los departamentos de Cochabamba, La Paz y  Santa Cruz. Figura 1.


     

    Figura  1. Perfil de bandas, producto de amplificación de muestras de ADN de Mycobacterium  tuberculosis.

     

     

    El detalle de las muestras es:

    Superior 1, 2, cepas de   Cochabamba; 3, Santa Cruz, 4-7, 9-15 cepas de   La Paz, 8, Marcador de tamaño.  Inferior; 1-9; 11-20 cepas de Cochabamba, 10, Marcador de tamaño.

    Para verificar la reproducibilidad de la técnica se amplificó las mismas muestras obteniendo el mismo número de bandas.

    Como resultado de esta tipificación por PCR, se observaron 9 perfiles diferentes  denominados  I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX, que se diferenciaron por el número y tamaño de bandas. La distribución porcentual de los genotipos en las muestras analizadas se encuentra en Figura 2.

     

     

    Figura 2. Distribución de los genotipos de Mycobacterium tuberculosis en Cochabamba, La Paz y Santa Cruz.

     

    En base a los resultados de la técnica IS6110-PCR, se realizó un análisis estadístico para determinar, la frecuencia relativa de los genotipos y realizar una  estimación poblacional de los mismos

    El análisis estadístico, indica la existencia de un genotipo  predominante que es el I, con porcentaje de 50%, siguiendo en importancia el genotipo III con 30,6%, luego el  II con 6,9%, el  VII con 4,2%, el grupo VIII con 2,8%. Los grupos IV, V, VI y IX, se presentaron en una sola muestra representando sólo el  1,4%.

    Respecto a la estimación poblacional,  con un intervalo de confianza del promedio a un 95%,  se puede concluir que el genotipo I, tiene un intervalo comprendido entre 38,5 y 61,5%, el III, entre 19,9 y 41,2% y el II, entre 1,1 y 12,8%; el resto de los genotipos se encuentran en intervalos de confianza muy bajos.

    Para determinar la distribución de genotipos de la bacteria en los tres departamentos se consideró las muestras provenientes de estos lugares. La distribución porcentual de los genotipos se expresa  en  la Figura 3.


    Figura 3. Distribución de genotipos de Mycobacterium tuberculosis por departamento.

     

    En la Figura 3, de distribución de los genotipos por departamento, se puede observar, que en los departamentos de Cochabamba y Santa Cruz, predomina el grupo I, que parece ser el genotipo responsable del mayor número de casos en dichos departamentos, pero se encuentra ausente en La Paz; el genotipo II, se presenta  en los tres departamentos, sin embargo en un porcentaje muy bajo en Cochabamba; el genotipo III, es predominante en La Paz, con un porcentaje del 50%, pero también se encuentra presente en Cochabamba y Santa Cruz en menor proporción; el resto de los genotipos se presentan con frecuencias relativas muy bajas. El análisis estadístico de “chi-cuadrado de pearson” y “Likelihood ratio”, con 95% de confianza, dio como resultado un p-value de 0,05 y 0,041 respectivamente, permitiendo concluir, que existe relación entre los genotipos  predominantes  que circulan y el  área  geográfica.

    Resultados de  IS6110-RFLP. Una vez adecuada la técnica, se procedió a trabajar con 25 muestras tomadas al azar. Los resultados de la hibridación se expresan en la Figura 4.

     

     

    Figura 4. Perfil de fragmentos de restricción de longitud polimórfica de IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, reconocidos por hibridación  con la sonda IS6110, marcada con digoxigenina.

     

    El detalle de muestras es: 1,  La Paz;  2-6,  Cochabamba.

    Observando los resultados de la hibridación de los fragmentos de longitud polimórfica de  IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, con la sonda  IS6110,   se observó la presencia de varias copias de la secuencia de inserción IS6110, en un número igual o mayor a 6, pero menor a 10. Es importante destacar que aquellas muestras que presentaron el mismo genotipo  por la técnica IS6110-PCR, presentaron  el mismo perfil  de fragmentos de restricción de longitud polimórfica de IS6110.

     

    DISCUSIÓN 

    El número de genotipos encontrados en nuestro estudio por la técnica IS6110 -PCR, muestra claramente el predominio de un genotipo en relación a los otros. Esta situación  puede explicarse porque en Bolivia existe una alta prevalencia de la enfermedad y en estudios previos se ha observado que los países donde la prevalencia es alta, el grado de parentesco entre las cepas de Mycobacterium tuberculosis es mayor a causa de la transmisión activa  y reciente en una comunidad como indican Sechi, et al.12 y Van Soolingen, et al.13.

    En relación a los perfiles  encontrados en los tres departamentos en estudio, se puede observar que son  similares  en el tamaño y número de bandas  encontrados en otros trabajos realizados con la misma técnica14.

    Como se ve en la Figura 2,  los genotipos I y, III, son los responsables del mayor número de casos, situación que ha sido reportada para otros países como Tanzania, donde indican que en algunas regiones sólo 2 ó 3 genotipos son responsables del mayor número de casos en una determinada región (Bauer, et al.15). Así también Zeng, et al.16 con la misma técnica, determinaron 8 grupos polimórficos de Mycobacterium tuberculosis en la China, de los cuales tres son predominantes en esa región.

    Respecto a la distribución y predominio del genotipo I en Cochabamba y Santa Cruz, podría deberse a la alta movilidad de las personas entre el valle y el oriente; sin embargo el grupo III, que es predominante en el departamento de La Paz, también se encuentra en Cochabamba y Santa Cruz y el grupo II en La Paz y Santa Cruz, esta situación muestra la diseminación de algunos grupos entre los tres departamentos, debido al frecuente traslado de personas infectadas de una región a otra.

    Estos resultados nos permiten concluir que existe relación entre los genotipos  predominantes que circulan y la región  geográfica, como explican Reniero17 y varios autores12,18 . Así mismo la diseminación de genotipos de un lugar a otro, debido a la frecuente emigración de pacientes fue establecida por Borgdorff, et al 19.

    En relación a la técnica PCR-RFLP, observando los patrones de bandas de  hibridación, se puede concluir que todas las cepas analizadas por ésta técnica, tienen varias copias de la secuencia de inserción IS6110, que se observan como fragmentos de longitud polimórfica con tamaños mayores a 0,9 Kb como indica Van Emden, et al. 4; que los productos obtenidos no deberán ser menores a este tamaño debido a que la enzima PvuII, corta la IS6110 produciendo fragmentos de 0,45 a la izquierda de la secuencia y 0,9 a la derecha y la sonda IS6110 híbrida con la  región derecha de la IS, el número de copias de IS6110, varia entre 6 y 9, aspecto muy importante puesto que se han reportado cepas que tiene de 2 hasta 20 copias; la mayoría de las cepas tienen esta secuencia  y el número puede variar significativamente de acuerdo a la región, incluso algunos países como en la India, encontraron cepas que no poseen esta secuencia de inserción.

    El número de bandas encontradas es bastante frecuente y ha sido reportado en  estudios realizados en otros países, es así que Hwang20 en Taiwán encuentra que la mayoría de las cepas circulantes en ese país, tiene un número de 6-16 copias, en Italia Sechi, et al.12 indica que los Mycobacterium tuberculosis de esa región presentan  un número mayor a 6 copias. A nivel de Iberoamérica, Díaz, et al.21 encuentra en Cuba  que las cepas tienen de 6-20 copias, y en Colombia  Gomez-Marin, et al.22, observó  que la mayoría de las cepas de la región del valle tienen un promedio de 10±3 copias, existiendo correlación con la zona geográfica.

    Respecto a la validación de la técnica IS6110-PCR por la técnica IS6110-RFLP, se encontró muy buena relación entre ambas técnicas, puesto que los grupos que presentaron perfiles diferentes y grupos diferentes por la IS6110,  también por la técnica IS6110-PCR, aquellos que se encontraban por RFLP en el mismo grupo, también se agruparon en un solo genotipo por PCR.

     

    AGRADECIMIENTOS 

    Al Convenio UMSS-CIUF, que apoyo económicamente la realización del presente trabajo de investigación; al Instituto Nacional de Laboratorios en Salud (INLASA) y a la Escuela Técnica de Salud de Cochabamba, que proporcionaron los cultivos de Mycobacterium tuberculosis.

     

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